技术原理

   CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA 进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠基因组特定基因位点进行精确编辑，目前瑞思元已经成功将此技术应用于小鼠基因敲除/敲入模型制备，以及条件性敲除（Loxp系统）模型制备。      

      目前瑞思元采取优化过的野生型Cas9和双切口Cas9n（Optimized Cas9 System,OCAS and OCASn）。采用优化过的双切口Cas9n(OCASn)可以将脱靶效应降到最低。

常规基因敲入

利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒和donor质粒，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变、报告基因（如EGFP、mCherry、RFP、LacZ等）或需要表达的功能性cDNA（如cre、Dre等）到目的基因的特定位点。

条件性基因敲入

利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒和donor质粒，将外源基因或特定突变敲入引入到基因组目的基因的特定位点。

Rosa26位点定点敲入

     根据Rosa26基因序列设计合成sgRNA，将构建包含同源序列和目的序列的片段与Cas9、sgRNA共同显微注射入受精卵中，Cas9/sgRNA复合体与基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含目的片段的同源序列为模版修复基因组DNA，最终获得在Rosa26基因intron中定点插入片段的大小鼠。

制备流程

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